Proteinrening och kromatografi

Behovet av reagens med hög renhet i biotekniska applikationer

Det bioteknologiska fältet innefattar en stor mängd applikationer och system som för sin funktion på ett eller annat sätt utnyttjar biomolekylära interaktioner. Medicin och diagnostik är två exempel på områden där denna typ av interaktioner är ytterst centrala. Utvecklingen och produktionen av produkter och metoder inom dessa områden, till exempel nya läkemedel eller diagnostiska tester, kräver utan undantag kemiska och biokemiska komponenter i mycket ren form samt av jämn och hög kvalitet. Reagenskvalitet är en fundamental aspekt i att säkerställa funktion och prestanda för biotekniska applikationer.

Getica är aktiva inom området in vitro-diagnostik (IVD), där interaktionen mellan antikroppar och deras korresponderande antigen ofta utnyttjas. Eftersom både dessa proteiner härrör från ett värddjur eller från odlade celler är en ständig uppgift att lyckas separera och isolera dem från det ofta biologiskt komplexa råmaterialet (t.ex. serum eller cellextrakt). Följande sektion beskriver några generella metoder för proteinrening med tonvikt på de metoder av störst relevans i Geticas reningsarbete av antikroppar och deras korresponderande antigen.

Kromatografiska tekniker

Proteinrening är samlingsbegreppet för de processer som används för att isolera ett eller flera protein från en komplex blandning. Isoleringen baseras på separation vilken ofta i en vetenskaplig kontext refereras till som kromatografi. Generellt sett utnyttjar kromatografiska metoder en eller flera egenskaper hos det protein man önskar isolera. Dessa egenskaper kan till exempel vara löslighet, storlek, laddning eller bindningsspecificitet. De kromatografiska metoder Getica använder sig av i störst omfattning är storleksuteslutningskromatografi (SEC), jonbyteskromatografi (IEC) samt affinitetskromatografi. Följande stycken beskriver dessa tre metoder närmare.

Att renframställa ett protein från en komplex blandning görs ofta i flera steg och med hjälp av flera olika kromatografiska metoder. Antalet steg och vilka kromatografiska metoder som är lämpliga beror exempelvis på proteinets egenskaper och den eftersträvade graden av renhet på slutprodukten. Hela proceduren för renframställningen inkluderar ofta andra preparativa steg som filtrering för att få bort aggregat eller partiklar, protein-koncentrering och/eller bufferbyte för att erhålla de rätta förhållandena för de olika kromatografiska metoderna. Vidare används dessa preparativa steg ofta för att slutprodukten ska möta slutanvändarens önskemål.

Storleksuteslutningskromatografi (SEC)

Storleksuteslutningskromatografi (SEC) separerar proteiner i en lösning baserat på deras storlek. Innehållet i en SEC-kolonn utgörs av en stor mängd icke-reaktiva porösa mikroskopiska kulor. Större proteiner tar en kortare väg genom kolonn-materialet eftersom de inte kan ta sig in i kulornas porer i samma utsträckning och elueras därför först. Mindre proteiner tar sig enklare in i kulornas porer och tar därför en längre väg genom kolonn-materialet. SEC är en kromatografisk metod med en förhållandevis mild påverkan på proteinerna då den inte kräver justeringar i t.ex. pH eller jonstyrka.

SEC är en kromatografisk metod som kan utnyttjas både i syfte att renframställa samt analysera proteiner. Exempelvis för att bestämma förhållandet mellan antikropps-monomerer och multimerer eller separationen av antikropps-monomerer från multimerer och nedbrytningsprodukter. Analytisk SEC kräver betydligt mindre provmängd jämfört med SEC för renframställning.

Jonbyteskromatografi

Jonbyteskromatografi (IEC) är en metod som utnyttjar skillnaden i olika proteiners elektriska laddning för separation. Metoden utnyttjar de elektrostatiska interaktionerna mellan proteiner och kolonn-materialet för att åstadkomma denna separation. Proteiner med en nettoladdning motsatt kolonn-materialet fastnar på grund av den elektrostatiska attraktionen, medan proteiner med samma nettoladdning elueras på grund av den elektrostatiska repulsionen.

Ett fenomen centralt för IEC är att ett proteins elektriska laddning påverkas av den omgivande lösningens pH-värde. Det pH-värde som för ett protein medför att dess nettoladdning är neutral kallas för dess isoelektriska punkt (pI). Vidare gäller att om omgivningens pH > pI får proteinet en negativ laddning, och följaktligen om pH < pI får proteinet en positiv laddning. Denna egenskap hos proteiner gör det möjligt att med hjälp av pH-värdet hos den omgivande lösningen styra hur proteiner interagerar med kolonn-materialet.

Affinitetskromatografi

Affinitetskromatografi är en mycket selektiv kromatografi-metod på grund av att den utnyttjar den specifika interaktionen mellan två biomolekyler för att åstadkomma separationen. Biologisk struktur och funktion är således de centrala biomolekylära egenskaperna som ligger till grund för denna separationsteknik. Interaktionen kan t.ex. vara den mellan antikropp/antigen, enzym/substrat eller receptor/ligand.

Grundprincipen i affinitetskromatografi är att den biomolekyl man ämnar separera ut från en komplex blandning har sin korresponderande interaktionspartner immobiliserad till kolonnmaterialet. När den komplexa blandningen sätts till kolonnen kommer den biomolekyl man ämnar separera ut att effektivt fångas av sin immobiliserade interaktionspartner. Övriga molekyler, som saknar en interaktionspartner i kolonnen, kommer att passera rakt igenom. När separationen så åstadkommits, och biomolekylerna av intresse fångats i kolonnen, kan dessa elueras genom att ändra egenskaperna hos bufferten som pumpas genom kolonnen. Ändring i jonstyrka eller pH-justering är två exempel på förändringar som kan försvaga den specifika interaktionen mellan biomolekylerna, vilket underlättar eluering.

Vill du veta mer om hur vi på Getica jobbar med renframställningen av antigen och antikroppar, besök gärna sidan för våra tjänster eller kontakta oss direkt.