Kromatografi – Renframställning av antikroppar och antigener

Behovet av reagens med hög renhet i biotekniska applikationer

Det bioteknologiska fältet innefattar en stor mängd applikationer och system som för sin funktion på ett eller annat sätt utnyttjar biomolekylära interaktioner. Medicin och diagnostik är två exempel på områden där denna typ av interaktioner är ytterst centrala. Utvecklingen och produktionen av produkter och metoder inom dessa områden, till exempel nya läkemedel eller diagnostiska tester, kräver utan undantag kemiska och biokemiska komponenter i mycket ren form samt av jämn och hög kvalitet. Reagenskvalitet är en fundamental aspekt i att säkerställa funktion och prestanda för biotekniska applikationer.

Getica är aktiva inom området in vitro-diagnostik (IVD), där interaktionen mellan antikroppar och deras korresponderande antigen ofta utnyttjas. Eftersom både dessa proteiner härrör från ett värddjur eller från odlade celler är en ständig uppgift att lyckas separera och isolera dem från det ofta biologiskt komplexa råmaterialet (t.ex. serum eller cellextrakt). Följande sektion beskriver några generella metoder för proteinrening med tonvikt på de metoder av störst relevans i Geticas reningsarbete av antikroppar och deras korresponderande antigen.

Metoder för renframställning av proteiner

Proteinrening är samlingsbegreppet för de processer som används för att isolera ett eller flera protein from en komplex blandning. Isoleringen baseras på separation vilken ofta från en vetenskaplig kontext refereras till som kromatografi. Generellt sett utnyttjar kromatografiska metoder en eller flera egenskaper hos det protein man önskar isolera. Dessa egenskaper kan till exempel vara löslighet, storlek, laddning eller bindningsspecificitet. De kromatografiska metoder Getica använder sig av i störst omfattning är storleksuteslutningskromatografi (SEC), jonbyteskromatografi (IEC) samt affinitetskromatografi. Följande stycken dessa tre metoder närmare. 

Storleksuteslutningskromatografi (SEC)

Storleksuteslutningskromatografi (SEC) separerar proteiner i en lösning baserat på deras storlek. Innehållet i en SEC-kolonn utgörs av en stor mängd icke-reaktiva porösa mikroskopiska kulor. Större proteiner tar en kortare väg genom kolonn-materialet eftersom de inte kan ta sig in i kulornas porer i samma utsträckning och elueras därför först. Mindre proteiner tar sig enklare in i kulornas porer och tar därför en längre väg genom kolonn-materialet. Se figur 1. SEC är en kromatografisk metod med en förhållandevis mild påverkan på proteinerna då den inte kräver justeringar i t.ex. pH eller jonstyrka.

SEC är en kromatografisk metod som kan utnyttjas både i syfte att renframställa samt analysera proteiner. Exempelvis för att bestämma förhållandet mellan antikropps-monomerer och multimerer eller separationen av antikropps-monomerer från multimerer och nedbrytningsprodukter. Analytisk SEC kräver betydligt mindre provmängd jämfört med SEC för renframställning.

Figur 1:

Schematisk illustration av size-exclusion chromatography (SEC); en teknik för separation av proteiner baserad på deras storlek. Kolonn-materialet, bestående av icke-reaktiva porösa kulor, orsakar denna separation. Mindre proteiner tar en längre väg genom kolonnen då de enklare tar sig in i kaviteter i kulorna. Större proteiner, som inte tar sig in i kaviteter i samma utsträckning tar en kortare väg och elueras därför tidigare.

Kromatografi proteinrening

Figur 1

Jonbyteskromatografi

Jonbyteskromatografi separerar proteiner baserade på deras laddning. Laddningen hos det protein som ska renframställas kan manipuleras med hjälp av pH-värdet hos omgivande lösning. Varje protein har en isoelektrisk punkt (pI), vilket är det pH-värde där proteiner är elektriskt neutralt. Vid ett pH lägre än pI är proteinet positivt laddad, och vid ett pH högre än pI är proteinet negativt laddat.

Kolonn-materialet i IEC är elektriskt laddat. När protein-provet sätts till kolonnen kommer proteiner med motsatt laddning interagera starkare med kolonn-materialet. Dessa proteiner elueras genom att ändra pH och/eller jonstyrkan på flödesbufferten.

Affinitetskromatografi

Affinitetskromatografi är den mest selektiva kromatografi-metoden Getica använder. Metoden utnyttjar den specifika interaktionen mellan två molekyler, t.ex. interaktionen mellan en antikropp och ett antigen eller mellan ett hormon och sin korresponderande receptor. Liganden (t.ex. ett antigen eller en receptor) sätts fast i ett kolonn-material, ett prov innehållandes analyten (t.ex. en antikropp eller hormon) sätts till kolonnen, och analyten binder reversibelt till sin korresponerande ligand. Genom att justera t.ex. pH och/eller jonstyrka försvagas interaktionen mellan ligand och analyt, och analyten elueras.

Proteinrening med flera kromatografiksa metoder

En eller flera av de ovan beskrivna kromatografi-metoderna används vid varje renframställning av protein hos Getica. Intermediära och slutgiltiga steg i renframställningsprocessen inkluderar även filtrering för att eliminera aggregat och partiklar, koncentration och/eller buffer-byte för att skapa de rätta förutsättningarna i nästa steg i reningsprocessen eller för att färdigställa slutgiltig produkt. 


Om du vill veta mer om hur vi på Getica jobbar med renframställningen av antigen och antikroppar, kika gärna på våra tjänster eller kontakta oss direkt.